Unerwünschte Veränderungen

Hat Genschere CRISPR-Cas9 auch Nebenwirkungen?

Die Genschere CRISPR-Cas9 kann menschliche Gene präzise verändern, aber auch unerwünschte Veränderungen an ihnen auslösen. LMU-Forscher können solche Fehler nun erstmals einfach nachweisen und zeigen, dass sie in Stammzellen häufig vorkommen.

CRISPR-Cas9

Nebenwirkungen von CRISPR-Cas9 | NIK, www.genome.gov

Die Genschere CRISPR-Cas9 hat die Molekularbiologie revolutioniert, da mit ihr Gene sehr gezielt verändert werden können. Sie wird mittlerweile in der Forschung breit eingesetzt und auch für die Therapie von Patienten gibt es erste experimentelle Anwendungen. Um verlässliche Forschungsergebnisse zu erhalten und Fehler zu vermeiden, ist es essentiell, dass die Veränderungen sehr exakt eingefügt werden. Allerdings funktionieren die aktuellen CRISPR-Methoden nicht ganz fehlerfrei und können ungewollte weitere Veränderungen im Genom verursachen. LMU-Wissenschaftler um den Neurobiologen Professor Dominik Paquet vom Institut für Schlaganfall- und Demenzforschung haben eine einfach anwendbare Methode entwickelt, mit der unbeabsichtigte Veränderungen, die im Zielgen selbst auftreten, nachgewiesen werden können – und zeigen, dass diese sehr häufig sind. Damit leisten die Forscher einen wichtigen Beitrag, die Anwendung von CRISPR in Forschung und Therapie sicherer zu machen.

Off-Target- und On-Target-Effekte möglich

Das CRISPR-Cas-System ermöglicht die präzise Veränderung von Genen, indem es den DNA-Doppelstrang an der Zielstelle durchschneidet. Anschließend fügen zelleigene Reparatursysteme den durchtrennten Strang wieder zusammen. Forscher können auf diese Weise Gene inaktivieren oder an der Schnittstelle neue DNA-Abschnitte einfügen. Ungewollte weitere Veränderungen der DNA können dabei sowohl an irgendeiner anderen Stelle der DNA entstehen – sogenannte Off-Target-Effekte – als auch im zu verändernden Gen selbst, was als On-Target Effekt bezeichnet wird. „Ein On-Target-Effekt kann dazu führen, dass CRISPR, statt eine spezifische Stelle des Gens zu verändern, seine Funktion reduziert oder ganz ausschaltet“, sagt Paquet. „Während Off-Target-Effekte schon recht gut verstanden sind und es gute Nachweismethoden gibt, kennt man On-Target-Effekte erst seit Kurzem – und es gab bisher noch keine in der Forschung akzeptierte und breit anwendbare Methoden, diese zu finden.“

Genschere

Wissenschaftler der Charité haben festgestellt, dass bei Menschen eine breite Immunität gegen das Protein Cas9 besteht. Um verschiedene Anwendungen der Genschere sicher zu machen, arbeiten die Forscher an ersten Lösungsansätzen.

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Nutzung der quantitativen Genotypisierungs-PCR

Deshalb entwickelten die Wissenschaftler eine einfache Methode, mit der sich On-Target-Effekte erstmals verlässlich nachweisen lassen. Die Methode basiert auf der bereits etablierten Charakterisierung des Genoms mithilfe der sogenannten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und wird von den Wissenschaftlern als quantitative Genotypisierungs-PCR (qgPCR) bezeichnet. Zusätzlich werden Veränderungen an Stellen im Genom untersucht, an denen sich von Mutter und Vater vererbte Gensequenzen unterscheiden.

On-Target-Effekte offenbar sehr häufig

Am Beispiel von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen haben die Wissenschaftler dann mit den neu entwickelten Methoden untersucht, ob nach dem Editieren des Genoms mit CRISPR On-Target-Effekte auftreten und wie verbreitet diese sind. Diese Zellen entstehen durch künstliche Reprogrammierung von Körperzellen und haben für Forschung und Therapie große Bedeutung. „Unsere Methode zeigt, dass On-Target-Effekte in CRISPR-behandelten menschlichen Stammzellen sehr häufig sind – je nachdem, welcher Reparaturmechanismus verwendet wird, können bis zu 40 Prozent aller Zellen betroffen sein“, sagt Paquet. In einem Zellkulturmodell für die Alzheimer-Erkrankung konnten die Forscher zudem nachweisen, dass das Auftreten von Symptomen durch solche ungewollten On-Target-Effekte behindert wird – ein Beispiel dafür, dass sie starke Auswirkungen auf die Ergebnisse von Studien mit CRISPR-veränderten Zellen haben können. Die neue Methode sollte nach Ansicht der Forscher als zusätzliche Qualitätskontrolle eingesetzt werden, um unbeabsichtigt veränderte Zellen zu identifizieren und damit die Zuverlässigkeit der Genschere CRISPR-Cas9 zu erhöhen.

 

Literatur:

Isabel Weisheit, Joseph A. Kroeger, Rainer Malik, et al.: Detection of Deleterious On-Target Effects after HDR-Mediated CRISPR Editing. Cell Reports, 2020, DOI: doi.org/10.1016/j.celrep.2020.107689.


Quelle: LMU