DNA-Polymerasen und andere Enzyme, die das Erbgut verändern, sind wichtige Werkzeuge in der Biotechnologie und Diagnostik. Vor allem in der SARS-CoV-2-Diagnostik haben sie jetzt Berühmtheit erlangt. Sie stellen die Schlüsselkomponente für die COVID-19-Diagnostik mittels PCR dar. Doch so nützlich sie auch sind, haben die DNA-verarbeitenden Enzyme oft erhebliche Schwachstellen. Einige von ihnen sind während der Probenvorbereitung sehr aktiv, manche haben störende Nebenaktivitäten. Beides kann dazu führen, dass Spezifität und Empfindlichkeit der Tests verloren gehen. Das muss bei einem diagnostischen Test unbedingt vermieden werden. Der Trick besteht darin, jegliche Enzymaktivität zu blockieren, bis der Test beginnt. Für diagnostische Tests, die auf PCR basieren, wie der Test für SARS-CoV-2, kommt bislang eine Methode zum Einsatz, die auf einem sogenannten Hot-Start-Enzym basiert. Dieses ist erst oberhalb einer bestimmten, hohen Temperatur aktiv.
Beschränkung von Hot-Start-Ansätzen
„Der größte Nachteil dieser Hot-Start-Ansätze ist, dass sie nicht für Enzyme verwendet werden können, die durch Hitze beschädigt werden“, sagt LMU-Biochemiker Andrés Vera. Außerdem sei das Design eines Hot-Start-Enzyms aufwändig. Gemeinsam mit seiner Kollegin Merve-Zeynep Kesici aus der Gruppe von Prof. Philip Tinnefeld hat Andrés einen Weg gefunden, diese Probleme zu umgehen. Die Wissenschaftler haben Enzyme entwickelt, die mit Hilfe eines Lichtpulses aktiviert werden. Ohne diesen Puls bleiben die Enzyme inaktiv, sind also blockiert. „Lichtgesteuerte Enzyme gibt es schon seit einiger Zeit, aber das Besondere an unserem Ansatz ist, dass er auf praktisch jedes DNA-verarbeitende Enzym angewendet werden kann“, sagt Vera, der das Projekt an der LMU leitet. „In der Vergangenheit brauchte man immer sehr detaillierte Informationen über die Funktionsweise des Enzyms, und man war sich nie sicher, dass man einen intelligenten Weg finden würde, das Enzym zu blockieren und es mit Licht zu reaktivieren.“
Einsatz besserer Enzyme
Konkret haben die Forscher ein Stück DNA an das Enzym gebunden. Der DNA-Schnipsel konkurriert mit allen anderen enzymatischen Substraten und macht das Enzym effektiv inaktiv – einschließlich seiner sekundären Aktivitäten. Der Lichtimpuls wird dazu verwendet, die an das Enzym gebundene DNA wieder abzutrennen, wodurch ein zu 100 Prozent aktives Enzym entsteht. „Der Hauptvorteil besteht darin, dass der Mechanismus für eine breite Palette DNA-bindender Enzyme funktionieren sollte, und zwar unabhängig von ihrer spezifischen Wirkungsweise“, sagt Vera.
Vier lichtaktivierbare Varianten hergestellt
Um dies zu belegen, stellten die Forscher vier lichtaktivierbare Varianten mehrerer DNA-verarbeitender Enzyme her. Darunter befand sich auch die sogenannte Phi29-DNA-Polymerase, ein Enzym, das häufig zur Vervielfältigung ganzer Genome verwendet wird, aber zu hitzeempfindlich ist, um für Hot-Start-Methoden geeignet zu sein. Das Team demonstrierte dabei jeweils nicht nur, dass die Licht-Start-PCR funktionierte. Ihre DNA-Polymerasen waren im Vergleich zu kommerziellen Hot-Start-Enzymen für die PCR gleich gut oder sogar besser. „Unser neuer Ansatz wird definitiv dazu beitragen, bessere Enzyme für biotechnologische und diagnostische Anwendungen herzustellen“, ist Philip Tinnefeld überzeugt. „Da die aktuellen Echtzeit-PCR-Geräte bereits mit Lichtquellen ausgestattet sind, könnten sie leicht angepasst werden, um diese Enzyme bald auf den Markt zu bringen.“
Quelle: idw/LMU
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